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【中国创造70年】“克隆猴”诞生背后:孤岛建猴场,试错5年

口述:中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心非人灵长类研景拿挪┎视蜗反笕主任 孙强

整理:《中国经济周刊》记者 宋杰

2017年11月27日,世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)的非人灵长类平台诞生;12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。该成果标志中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代,实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。

体细胞克隆猴“中中”“华华” 日常生活状态

体细胞克隆猴“中中”“华华” 日常生活状态(中科院脑智卓越中心供图)

精子和卵子各携带一半遗传物质,相互结合在一起,形成受精卵并发育成一个新的个体,这是大家熟知的哺乳动物生殖方式,但体细胞克隆却用“狸猫换太子”的手法,将一个体细胞里的染色体(即DNA)替换掉卵细胞中的DNA,再让这个卵细胞用体细胞里的DNA完成新个体的孕育,其难度不言而喻。

自从1997年“多莉羊”体细胞克隆成功后,已有超过20种哺乳动物的克隆由全球多个生物医学机构相继实现。其中,实验小鼠是生命科学研究与新药研发最重要的模式动物之一,为科学家发现生命奥秘、帮助人类研发新药,立下了赫赫功勋。

不过,真正让全世界顶尖科研团队紧紧盯住的目标始终只有一个——猴。因为灵长类的进化跟人类非常接近,对认识人类的大脑、脑认知功能和脑疾病有非常大的潜在应用价值。

21世纪初,美国匹兹堡大学的科研人员在《科学》上发文称,用体细胞克隆非人灵长类动物的理想是不可能实现的。当时,俄勒冈大学教授米塔利波夫撰文指出,科学家更应该从人迹罕至的科学道路上发现不寻常的风景。但在2011年,他在尝试了15000枚猴卵细胞后失败了:他制备的克隆猴在怀孕81天后流产。而这已是在这个领域取得的最好成绩。

中国科学家能不能有所突破?能!中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)孙强研究员率领以博士后刘真为主的团队,经过5年的不懈努力,终于在国际上首次实现了非人灵长类动物的体细胞克隆。

2017年11月27日,世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)的非人灵长类平台诞生;12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。该成果标志中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代,实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。

那么,这个里程碑式的转变背后有什么故事?本文系中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心非人灵长类研景拿挪┎视蜗反笕主任孙强作为亲历者对我国在体细胞克隆猴从孕育到诞生全过程的回顾,并授权《中国经济周刊》刊发。

零起点遇伯乐

团队主要成员:蒲慕明(中)、孙强(左)、刘真(右)

团队主要成员:蒲慕明(中)、孙强(左)、刘真(右)(中科院脑智卓越中心供图)

2001年,国外有了转基因猴,当时中国不仅没有转基因猴,连试管猴也未见报道,而国外早在1984年就有了试管猴。

为了做出转基因猴,我在博士毕业后,没有选择去国外做博士后,而是在2004年去了西双版纳的一座山上的养殖场开展猴生殖生理和转基因猴构建的研究。这个决定对于我来说并不容易,当时妻子孩子都在扬州,我两个月才回一次家。尽管每次上山都要坐缆车,一周下山一次去买菜,我却在这里待了将近4年。

经过近4年的努力,虽然掌握了非人灵长类辅助生殖技术并得到了试管猴,但却没能得到转基因猴。随着原单位研究项目的结题,我继续开展非人灵长类相关研究的科研条件也将失去。尽管我心里还一直惦记着自己热爱并全身心投入的研究领域,但现实的困境逼迫我不得不考虑转变科研方向。

幸运的是,2009年,恰逢中国科学院神经科学研究所制定发展“路线图”的阶段性目标,计划开辟能够引领学科发展的、增强国际科技竞争力的、有应用价值的非人灵长类研究领域,神经所蒲慕明院士感受到了我内心从事非人灵长类研究的强烈科研欲望,决定把建设非人灵长类研景拿挪┎视蜗反笕的重任交给我,我所热爱的科研事业迎来了梦想中的春天。

上孤岛建猴场

来到神经所后,考虑到从头建设非人灵长类设施需要花费数年时间,我又一次选择在一个远离家乡和核心城市,在位于太湖中一个小岛上的猴场,通过租用设施来实现尽快起步。

在岛上最初的交通工具是自行车和电瓶车,这方便我们去镇上收取试剂和耗材等快递包裹。如果我们要出岛,主要坐69路公交,距离市区较远,我们需要坐60站路大约2小时的车程才能到火车站。

早期岛上没有食堂,吃饭也是需要解决的问题,我们给每个宿舍都配备了厨房,大家轮流买菜做饭,到了节假日的时候还会组织一些集体聚餐,让大家展示自己的厨艺,这样既解决生活上的问题,又增进了同事之间的感情。在生活上,我们就像一家人;在工作中,实验室就是我们的家。由于比较潮湿,实验室一楼的墙壁发黄甚至发霉,员工就自发组织起来,利用空闲时间粉刷墙壁和天花板,美化家园。

2010年国庆假期的一个雨夜,在从基地返回宿舍没有路灯的路上骑行时,我摔断了锁骨。但当时正是实验的关键节点,且还没有培养出能够替代我的人,我只好悬着胳膊继续干了一个星期。实验做完再去医治的时候,医生发现摔断的锁骨已错位,不得不重新切断后再接上。

这样的付出是值得的,2011年,我们成功得到了世界上首批携带人类自闭症基因的猴模型;其后我们成功开发了实验猴成熟加速技术,将食蟹猴的繁殖周期从5年以上缩短到2.5年;我们还建立了基于分子核酸酶的基因编辑猴模型构建技术,这些工作对整个中国非人灵长类研究起到了推动作用。

但是,上述方法构建的模型猴仍然存在首建动物嵌合、脱靶和遗传背景不均一等问题。2012年我毅然接下了攻克非人灵长类体细胞克隆技术这一重任,试图解决这些问题。

试错5年“步步为营”

20多年来,国际上多个顶级实验室都铩羽而归。世界公认的克隆专家米塔利波夫前后用了1.5万枚猴卵,却仍以失败告终。国际上一度悲观地认为体细胞克隆猴不可能成功。尽管如此,我和我的团队还是冒着很可能失败或很长时间没有成果的风险,开始了体细胞克隆技术的攻关。

但我必须在前人失败的基础上思考如何攻关。体细胞克隆猴实验做了5年,我的团队也失败了5年。深深的挫败感时常使大家感到非常痛苦和沮丧。我也经常勉励大家,做最坏的打算,尽最大的努力。

在体细胞克隆猴技术具体操作上,主要有两大难点。第一是拿掉细胞核的时候不能抽掉周围太多营养物质,否则细胞就会停止发育。此外,移植到卵细胞中的是成熟的、只表达某些特定基因的体细胞细胞核,研究人员需要想办法让它重新变成一个未分化的全能胚胎细胞。

由于猴子细胞不透明,在显微镜下看不到细胞核,需要通过偏振光才能把细胞核显示出来。我们的研究人员注视着显微镜,在一闪一闪的偏振光下,操纵直径10微米左右的极细针头在细胞里吸取、注射,并尽可能减小对细胞的损伤,其难度远大于操纵绣花针。最终,我们的团队成员可以做到15秒内实现体细胞注入操作,只有精湛的技术才可以保证对卵细胞损伤最小。 

而在核基因组启动前,体细胞核要经历一个回复到早期胚胎核状态的过程,也就是“重编程”。只有将这个过程控制好,才能提高体细胞胚胎的发育率。

协同作战

说个小故事。因为平台的猴子是在室温下养的,所以低温或者酷暑的时候,大家都特别担心。2016年抗洪救灾那一次,记得那是一个周末,神经所每个小时都与我们联系,包括晚上。星期天下午两点,水位已经很危险了,当时只能出人不能进人。所里领导担心我们,他对我说:“仪器、猴子不用管了,你们赶快撤。”

但等我们再次通话时,我告知他仪器已经搬回原处。他当时很惊讶,问我撤到哪里,可以如此快回来。我说:“撤的是女同胞,而男生都在那里等着。”只有拥有这种热爱集体、国家利益大于自己利益的精神,才会取得重大突破。

在尝试各种调控方法效果均不理想后,2014年,我们在一篇报道中看到一种新的酶处理方法,并最终用这一方法将囊胚率提升到45%,优质胚胎率升高到29%。最终,我们用127枚卵母细胞,做了109个重构胚胎,对21只猴子受体进行移植,获得6只怀孕受体,最后只有两只在2017年顺利出生。

世界前沿难题的突破需要精干高效的攻关团队。“志同道合”是让我们能在一起拼搏的关键。作为“队长”的我,必须与团队同甘共苦,而不是发号施令的“老板”,我和大家一起生活在基地,同吃同住。对新手,我会手把手地从零开始教,让他们快速成长,同时培养他们的使命感、荣誉感和归属感。

在我的团队,学位、出身都是虚浮之物,他们大多没有光鲜夺目的背景,但经过我们平台的培训和自己的大胆探索以后,他们都成为了“身怀绝技”的顶尖人才,在各自岗位上发挥着核心作用。正是大家“协同作战”,才使得我们最终走向了成功。

2017年底,在历尽5年艰辛后,终于有了回报,世界上首批体细胞克隆猴“中中”和“华华”顺利诞生了,该工作也被评价为:“新的里程碑”式的突破。

关于取名

大家对“中中”“华华”的名字非常感兴趣,外媒也解读“中华”的名字。

当时蒲慕明院士和我们团队讨论,如果这篇学术论文出去投稿,这两个克隆猴宝宝应该有名字,叫什么好呢?蒲院士看着我和刘真说:你们有“特权”,一人起一个,叫“强强”“真真”,寓意“真强”?我们二人几乎同时摇头,都说让蒲院士起名字。

他想了一会儿,问“中华”如何?“中中”“华华”。我们齐声说好!虽然起名字只有几分钟,但后来想想,中华复兴梦在大家心里已经藏了很久。

克隆猴体细胞的成功得益于天时、地利、人和,缺一不可。

掌握了体细胞克隆猴的技术只是开始,接下来我们会组织更多的力量,尽早研制出国际上首批用体细胞克隆猴技术研发的疾病模型猴和工具猴。

展望未来,我们将再接再厉,在体细胞克隆猴领域不断产生原创性的重大突破,抢占国际上疾病克隆猴模型发展的先机,力争在世界上最先获得阿尔茨海默病、帕金森综合征等脑疾病的克隆猴模型,为脑疾病的机理研究、干预、诊治贡献自己的力量。

此外,我们也将积极探索相关技术的产业化,推动我国率先发展出基于非人灵长类疾病动物模型的全新医药研发产业链,推进重大脑疾病、免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程,为人类的健康和中国经济发展贡献力量。

后记:

2019年1月,孙强团队与同属于中科院脑智中心的张洪钧团队合作,再获佳绩:在利用CRISPR/Cas9技术成功构建世界首批核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型的基础上,孙强团队通过一只症状最明显的公猴的体细胞克隆出5只小猴。这项进展说明,中国科学家已可以批量生产遗传背景均一的疾病猕猴模型。

编辑 | 陈栋栋

编审 | 张   伟


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(网络编辑:何颖曦)
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